一、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

 細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩大類。本實(shí)驗(yàn)室主要是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、miRcroRNA轉(zhuǎn)染、慢病毒轉(zhuǎn)染、藥物轉(zhuǎn)染、多肽轉(zhuǎn)染等。

二、miRcroRNA轉(zhuǎn)染

（一）實(shí)驗(yàn)材料及試劑

        六孔板、CO₂培養(yǎng)箱、EP管、酒精燈等；無血清培養(yǎng)基、MEM-α或DMEM、RNA、lipofectamine 2000、MSC細(xì)胞等。

（二）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1當(dāng)六孔板中MSC細(xì)胞密度達(dá)90％時，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染，將無血清培養(yǎng)基、MEM-α或DMEM取出復(fù)溫并注意平衡好；

2取出細(xì)胞，將培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，放回孵箱培養(yǎng)；

3取滅菌的EP管，按要求混好RNA（約100pmol/孔），每管250ul DMEM，混勻；

4另取EP管，加入lipofectamine 2000（5 ul/孔）和MEM-α或DMEM（250ul/孔），輕輕混勻后室溫靜置5min；

5將上述兩個EP管混勻；

6室溫靜置20min，將lipofectamine 2000-質(zhì)?；旌弦旱蔚搅装逯校?00ul/孔；

7將細(xì)胞放回孵箱培養(yǎng)，4h后換回含血清的*培養(yǎng)基。

（三）注意事項(xiàng)

1轉(zhuǎn)染的時候培養(yǎng)基中不能添加抗生素?？股?，比如青霉素和鏈霉素，一般對于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素。

2如果在無血清條件下轉(zhuǎn)染，使用含血清的正常生長培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞鋪板。在加入復(fù)合物前移去生長培養(yǎng)基，替換為0.5mL無血清培養(yǎng)基。

3在37℃，5％的CO₂中保溫24-48小時，無須去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基或者在4-5小時后更換生長培養(yǎng)基也不會降低轉(zhuǎn)染活性。